1. 缓冲液准备:使用无菌的双蒸水稀释去死细胞试剂盒中的 20x 结合缓冲液,制备 1x 结合缓冲液,贮存于 2-8℃。
2. 样品准备:待处理的细胞样品过 30μm 细胞筛,计数,300xg 离心 10 分钟,彻底弃上清。
3. 磁珠标记:按每 10^7 个总细胞 100μl 去死细胞磁珠的比例重悬细胞,混匀,室温(20-25℃)孵育 15 分钟。如有需要,加入 1x 结合缓冲液补足体积至 500μl。
4. 准备分选柱:取MS柱或LS柱置于相应的分选器磁场内,加适量 1x 结合缓冲液润洗(MS 柱加 500μl,LS 柱加 3ml)。
5. 磁分选:将细胞悬浮液加至分选柱,收集含有未标记细胞(活细胞)的流传液。加适量 1x 结合缓冲液洗涤分选柱(MS 柱加 4 次 500μl,LS 柱加 4 次 3ml),收集流穿的未标记细胞(活细胞),与上一步收集的活细胞合并。
6. 标记细胞洗脱:从分选器取出分选柱置于合适的收集管上,加适量缓冲液(MS 柱加 1ml,LS 柱加 5ml)用注射器用力推入分选柱,立即将磁标记的细胞冲出。
7.(可选)活细胞富集:为了提高磁分选去除死细胞的效率,活细胞部分可以在第二根 MS 柱或 LS 柱上富集。使用一根新的分选柱,重复上述步骤 4-6。
8. 使用台盼蓝染色镜检,或使用 PI 或 7-AAD 染色进行流式细胞分析。